于和伟1996年,他在上海戏剧学院出演了个人首部话剧《借我一个男高音》。1997年,于和伟去了南京军区前线话剧团。1999年,参演个人首部电视剧《
曹操》,从而正式进入演艺圈。2000年,出演都市情感剧《深圳女人》。2002年,出演苏舟执导的反腐剧《省委书记》;同年,出演都市喜剧《王记大排档》,在剧中饰演王记排挡的厨师西瓜。2003年,在高希希执导的抗战剧《
历史的天空》中饰演任军分区副政委万古碑;同年,出演近代传奇剧《
大宅门2》,在剧中饰演白景琦孙子白占安。2004年,于和伟与李雪健,殷桃联袂主演情感伦理剧《
搭错车》,在剧中饰演阿美的亲生父亲苏民生;12月20日,其参演的抗战剧《
追日》播出,在剧中饰演日本人木村一郎;同年,出演抗战剧《
敌后武工队》。于和伟2006年10月12日,与侯勇,丁志诚,殷桃等人合作主演的都市情感剧《
真情年代》在中国中央电视台电视剧频道播出,于和伟在剧中饰演循规蹈矩的知识分子李和平;12月,出演严敏求,许亚军联袂主演的家庭伦理剧《
孝子》播出,他在剧中饰演乔水兰的丈夫沈致公;12月13日,于和伟与许晴,殷桃,王伯昭等人共同出演的都市商战剧《
局中局》播出,于和伟在剧中饰演赵天宇的孪生哥哥周英文。2007年,出演高希希执导的伦理情感剧《
男人底线》,在剧中饰演阴冷顽固的赵通达;之后,于和伟在吴君如主演的爱情喜剧《我爱芙蓉姐》中饰演广告公司总经理常青;4月6日,其参演的抗战剧《
霓虹灯下的哨兵》播出,在剧中饰演前线文工团演员郝铁蛋;同年,在郑方南执导的军旅爱情剧《战地浪漫曲》中饰演心肠好的唐副司令。2008年11月22日,主演高希希执导的年代情感剧《
纸醉金迷》,他在剧中饰演的投机倒把的奸商范宝华;11月23日,与马伊琍合作主演的都市情感剧《
锁春记》播出,于和伟在剧中饰演商界精英庄世博;11月25日,主演的情感剧《漂亮的事》在中央电视台电视剧频道播出,他在剧中饰演国有企业的副厂长江百川;12月4日,出演的都市悬疑剧《
面具》播出,他在剧中饰演身价数千万,业内翘楚的著名精神心理学博士常思远;此外,他还出演了年代革命剧《
光荣岁月》;同年,主演刑侦剧《
华容道》,在剧中饰演南华的老板郭林。2009年6月,凭借电视剧《纸醉金迷》入围第15届上海电视节白玉兰奖最佳男演员奖。2010年5月2日,与陈建斌,陆毅,倪大红合作主演的古装剧《
三国》播出,在剧中饰演三国时期蜀汉开国皇帝刘备;7月11日,与胡军,梅婷合作出演的都市情感剧《岁月》在北京卫视播出,他在剧中饰演性格善良的现代机关干部吴过;9月6日,主演的年代战争剧《
家仇》在东方卫视播出,于和伟在剧中饰演个性冷静凶残多变,老谋深算的军阀张天心;9月20日,与侯勇,唐文龙联袂主演的抗战剧《
特战先锋》播出,他在剧中饰演军统局二号人物毛人凤;10月20日,其参演的近代革命剧《
冰是睡着的水》播出,他在剧中饰演敌对组织的特工周新宇;12月,与林永健,何赛飞共同主演的都市情感剧《
老马家的幸福往事》播出,他在剧中饰演的莫文辉,为了不再过无家可归的生活,他放弃自己心爱的女人马拉,又用一生为了爱情赎罪;随后,与罗海琼搭档主演的都市情感剧《幸福在路上》,于和伟在剧中饰演相貌英俊,性格豪爽的军区参谋马刚。2011年,凭借电视剧《幸福在路上》获得南方盛典最佳男演员奖;3月18日,主演的年代谍战剧《
青盲》播出,他在剧中饰演有勇有谋,代号“青盲”的共产党王牌特工张海峰;5月16日,与谷智鑫,李沁,徐百慧等人合作主演的近代革命剧《
中国1921》播出,他在剧中饰演任北京大学文科学长的陈独秀;10月19日,主演的谍战剧《
兵临城下》上星播出,于和伟在剧中饰演的杨少诚,想扛枪打仗的热血青年,因祖业岌岌可危,被逼无奈扛起了振兴家业的重托。影视形象2012年2月29日,其作为嘉宾参加的娱乐访谈节目《非常静距离》播出;5月22日,获得MSN星月年度最具价值男演员奖;6月10日,与佟瑞欣,赵恒煊,海顿等人合作主演的谍战剧《
奸细》在山东电视台影视频道播出,他在剧中饰演军统关州总负责人江一平;6月25日,主演的都市情感剧《
男人的战争》播出,在剧中饰演冶金大院三兄弟之首唐季山;10月1日,其参演的军旅剧《
我是特种兵之利刃出鞘》播出,于和伟在剧中饰演铁拳团团长康雷;10月22日,与王丽坤合作主演的抗战剧《
连环套》播出,他在剧中饰演中共地下党孟庆凡;11月7日,与刘威葳,刘钧联袂主演的家庭情感剧《
大家庭》在中央电视台综合频道播出,于和伟在剧中饰演的袁刚,诚恳仗义,是70年代末拖家带口的回城知青;12月28日,参演的古装武侠剧《
楚汉传奇》播出,于和伟在剧中饰演中国第一代皇帝秦始皇。2013年2月4日,于和伟与杨童舒,李依晓,霍青等人共同主演的家庭伦理剧《
天下人家》播出,他在剧中饰演入殓师唐中秋;12月15日,与王丽坤搭档主演的抗战剧《
零下三十八度》在东方卫视上星播出,于和伟在剧中饰演诈死隐居的国民党特工年定邦。2014年4月28日,与王丽坤合作主演的都市时尚情感剧《
爱的多米诺》播出,他在剧中饰演玩具设计师戴谷顺;8月14日,于和伟与刘涛,邵汶联袂主演的都市情感剧《
下一站婚姻》播出,他在剧中饰演转业特种兵龚箭,其后,他凭借该剧获得了第17届华鼎奖当代题材最佳男演员奖;同年,他还主演了刑侦剧《
刑警队长》,于和伟在剧中饰演的刑警队长顾铭,不仅率领队友屡破大案保卫城市安全,还是一位爱妻儿孝顺父母的好男人。2015年1月,与刘欢,叶璇联袂主演抗战剧《搜索连》,在剧中饰演师长吴休葆;4月15日,于和伟与何晟铭,白冰联袂主演的都市情感剧《婚前协议》上星播出,他在剧中饰演时装设计公司董事长高寒;5月25日,与祖峰,叶一云,张延合作主演的刑侦剧《刑警队长》,于和伟在剧中饰演的顾铭,既是智勇双全,刚柔并济的“人民卫士”,也是一位拥有着敏锐洞察力,坚忍耐力,执着信念的刑警队长;9月,与侯梦莎,黄梦莹,金美伶等人合作出演的现代青春励志剧《
警花与警犬》开机,于和伟在剧中饰演的杜飞,在刑侦工作岗位上勇于担当,明察秋毫,具备良好的职业素质和过硬的侦查能力;随后,他还出演了贺岁片《
过年好》;12月23日,作为嘉宾出席了第30届中国电视剧飞天奖典礼;12月24日,与冯小刚,张涵予,许晴合作出演的剧情片《
老炮儿》上映,于和伟在片中饰演温柔中带着霸气的龚叔。于和伟爆魅力写真2016年1月15日,与黄渤,孙红雷,黄磊等人合作主演的喜剧片《
极限挑战》上映,他在片中饰演明朝皇帝永历帝;3月,主演古装权谋剧《
大军师司马懿之军师联盟》,在剧中饰演进可金戈铁马,退可赋诗歌怀的枭雄曹操;5月15日,与朱雨辰,李小冉共同出演的年代谍战剧《
追击者》播出,于和伟在剧中饰演军统特工曹若飞;7月22日,其出演的悬疑片《
魔都凶音》上映,他在片中饰演史总;11月18日,与范冰冰,郭涛合作主演的剧情片《
我不是潘金莲》上映,饰演新任县长郑重;同年,主演都市情感轻喜剧《下一站,别离》,在剧中饰演成熟稳重,低调务实的公司高管秋阳。2017年,于和伟担纲艺术总监并领衔主演刑侦缉毒剧《
猎毒人》,在剧中饰演滨江市飞鹏生物化学科技研究室创始人吕云鹏;7月27日,其出演的革命史诗片《
建军大业》上映,于和伟在片中饰演时任中共中央总书记陈独秀;9月16日,凭借电影《我不是潘金莲》获得第31届中国电影金鸡奖最佳男配角;11月28日,其参加录制的阅读推广季播节目《见字如面第二季》在黑龙江卫视播出;12月,于和伟凭借其主演的电视剧《大军师司马懿之军师联盟》获得第8届澳门国际电视节最佳男配角提名,以及中国年度新锐榜年度艺人。2018年,凭借电视剧《大军师司马懿之军师联盟》获得第24届上海电视节举行“白玉兰奖”最佳男配角;4月16日,为电视剧《下一站,别离》演唱的插曲《青春告别诗》正式上线;4月28日,其参演的犯罪悬疑片《
幕后玩家》上映;之后,凭借电视剧《刑警队长》,《大军师司马懿之军师联盟》入围第31届中国电视剧飞天奖优秀男演员奖;6月,以飞行嘉宾身份参加了湖南卫视生活服务纪实节目《
向往的生活第二季》;7月15日,其作为飞行嘉宾参加的励志体验真人秀节目《
极限挑战第四季》在东方卫视播出;7月20日,其参演的现代探险剧《
沙海》在腾讯视频播出,他在剧中饰演吴邪的三叔吴三省;8月10日,其参演的电影《
一出好戏》上映;9月,其作为飞行导师参加的演技竞演类励志综艺节目《
我就是演员》播出;10月14日,凭借电视剧《大军师司马懿之军师联盟》入围中国电视金鹰奖观众喜爱的男演员奖。2019年3月5日,获得电视剧品质盛典活动年度实力演技剧星;4月8日,其特约主演的古装神话剧《
封神演义》播出,于和伟在剧中饰演周朝开国丞相姜子牙;9月7日,获得第十七届电影表演艺术学会奖;12月31日,主演的爱情喜剧片《
宠爱》上映,在片中饰演高铭。2020年,与雷佳音,张国立,周冬雨主演了动作片《
坚如磐石》,在剧中饰演富商黎志田;10月1日,参演的电影《
我和我的家乡》上映,片中饰演姜伟岸。11月26日,参演的献礼剧《
大决战》开机,将在剧中饰演林彪,该剧于次年3月16日杀青;12月13日,主演的检察剧《
巡回检察组》播出,在剧中饰演东川省巡回检察组组长冯森。西装照2021年1月9日,与章子怡,周一围搭档主演古装历史剧《
上阳赋》,在剧中饰演王儇的父亲王蔺;2月1日,与张桐,侯京健主演的近代革命剧《
觉醒年代》播出,在剧中饰演陈独秀;2月12日,与雷佳音,杨幂,董子健合作主演的悬疑片《
刺杀小说家》上映;4月30日,主演的谍战题材电影《
悬崖之上》上映,在片中饰演潜伏敌人内部多年的特工周乙;6月25日,参演的电视剧《大决战》开播;7月1日,参加的庆祝中国共产党成立100周年文艺演出《伟大征程》播出,与张桐,刘烨,白宇,邓伦,宋轶,杨洋,李现,杨紫合作表演《
破晓》;8月12日,于和伟在播出的《
理想之城》里饰演赵显坤;10月,成龙电影A计划第五期公布了创投项目评审团及拍摄工作坊导师团阵容,于和伟加盟创投评审团;10月15日,于和伟加盟原创喜剧竞演综艺《
一年一度喜剧大赛》,担任嘉宾。2022年1月,主演的电视剧《我是刑警》在哈尔滨杀青;9月23日,参加的原创喜剧竞演综艺《
一年一度喜剧大赛第二季》播出,并担任组委会会长;11月1日,加盟《金钥匙创投计划》;11月6日,参加第14届金鹰节颁奖晚会;11月29日,于和伟上线新歌《只字不提》。2023年1月15日,领衔主演的科幻剧《
三体》播出,在剧中饰演刑警史强;1月28日,获评国家一级演员;3月,参演的《
城中之城》在上海举行了开机仪式,在剧中饰演赵辉;3月30日,获得《剧耀东方·2023电视剧品质盛典》品质榜样剧星;5月10日,参演的电视剧《城中之城》官宣阵容。6月22日,参加的中央广播电视总台端午特别节目《碧水长歌颂端阳》播出,在节目中表演交响诵读《九歌·东皇太一》;9月28日,主演的犯罪警匪电影《坚如磐石》上映,并献唱该电影推广曲《石头决定开花》;10月27日,主演的黑色喜剧电影《
二手杰作》上映。